TALLADO

Para poder llevar a cabo los procesos de inclusión, corte y coloración, primero debemos realizar el tallado de las partes que deseamos observar en el microscopio para poder diagnosticar.

Este proceso de tallado suele realizarse sobre la parte mas representativa de los órganos, cortando aquello que deseamos observar posteriormente, en un tamaño adecuado para el casete en el que se depositaran, para su conservación en formol antes de ser introducidos en la procesadora

y de esta forma empezar todo el proceso.

Casetes en el que se depositaran las muestras ya talladas

PROTOCOLO INFILTRACIÓN EN PARAFINA

PROCESADORA

Una vez fijadas las piezas en formaldehido al 4% en los diversos casetes identificados, estos se llevarán a la procesadora y se pondrán en las respectivas cestillas para obtener un total de 12 procesos con unos tiempos y concentraciones de reactivos específicos que ahora comentaremos.

La procesadora: consta de 12 cilindros donde se distribuyen los reactivos. Mediante la programación de los tiempos, la procesadora, al finalizar estos, se alza y rota para cambiar la muestra de reactivo. Esto ocurre sucesivamente hasta la finalización del proceso.

Los reactivos que contienen los 12 cilindros de la procesadora son los siguientes. Marcaremos también su concentración y tiempos, además de su orden.

En primer lugar, y correspondiente con la fijación, obtendremos dos cilindros con formol en el cual las piezas estarán un tiempo de 1:00 hora en cada uno. El fijador penetrará en el tejido lentamente por lo que favorecerá su conservación.

En segundo lugar y correspondiente con la deshidratación de las piezas, se utilizarán etanoles en concentraciones crecientes. 1:30 horas x3 (70% 80% 96%) 1:00 horas x3 (100% 100% 100%). De esta forma completaremos 6 cilindros de la procesadora. La deshidratación se utiliza para la eliminación del agua de la muestra ya que la presencia de esta dificulta la impregnación e inclusión en parafina ya que presenta un carácter hidrófobo.

En tercer lugar va el aclaramiento conformado por dos cilindros de xilol. Los tiempos serán de 1:00 hora cada uno. La aclaración es el paso de las concentraciones de etanoles a etanol puro  en el cual ya no queda ningún porcentaje de agua. La utilización de dos cilindros se debe a la reducción de restos de agua en este último y hacer que la muestra presente una mayor pureza.

Por último tenemos la impregnación en parafina. Consta de dos cilindros en los cuales tienen que estar las muestras 2:00 horas en cada uno. La muestra se " rebozará " en parafina para que se lleve mejor a cabo la fabricación del bloque.

Después de estos doce pasos la muestras saldrán de la procesadora y se dispondrán para ser incluidas en un bloque.

A continuacion incluiremos el procedimiento para obtener las concentraciones de los etanoles:

PROCESO DE CONFECCIÓN DE BLOQUE

Esta vídeo nos muestra el procedimiento para la confección de un bloque.

MICROTOMO

Un microtomo es una herramienta que se utiliza para la obtención de finas láminas de material denominadas SECCIONES permitiendo su posterior observación en microscopios de luz transmitida o de radiación de electrones.
Dependiendo del tipo de material, de su fisiología y de su composición utilizaremos cuchillas de acero, vidrio o diamante; se debe tomar demasiada precaución debido a que la cuchilla tiene demasiado filo.
Las medidas de sección de corte habituales en la microtomía son de 1 a 50 micras, pero varían según el tipo de muestra y según el microscopio en el que se desee observar la muestra.

Para proceder al corte debemos tener:
- Palangana de hielo
- Cubeta con agua fría
- Baño de agua caliente (50ºC)
- Pinzas
- 2 pinceles
- Punzón
- Brocha
- Portaobjetos
- Bloque de muestra

PROCEDIMIENTO DE CORTE:

Antes de poder proceder a realizar el corte la biopsia debe ser sometida a un proceso en el que es infiltrada en parafina para poder intensificar el endurecimiento, también debe confeccionarse el bloque.
Finalmente procederemos al corte por medio del microtomo.

Primeramente debemos fijarnos en que todos los ángulos (10º) y posiciones estén en su sitio, también debemos fijarnos en lo cercana que se encentra la cuchilla y ajustarla adecuadamente para no ocasionar daños a la muestra. (Acercaremos manualmente hasta que se observe una distancia prudencial y continuaremos acercándonos con el rotador milimétrico que podemos encontrar en el microtomo)
*La muestra debe estar constantemente fría y cada vez que dejemos de hacer uso del microtomo bloquear el rotor y observar que todo se encentre ajustado adecuadamente.
Devastaremos el bloque de parafina con un grosor de 20 a 15 micras; cuando la superficie esta lisa, continuaremos devastando con 5 o 6 micras durante unas cuantas rotaciones de más, luego se pone a enfriar el bloque para que sea posible el posterior corte.
Una vez ha sido devastado el bloque procederemos a cortar las muestras que deseamos ver
en el microscopio, con ello utilizaremos las pinzas para poder coger las láminas de parafina y poder depositarlas en la cubeta de agua fría, ahí seleccionaremos las láminas optimas y las separamos del resto por medio del punzón.
En la cubeta de agua fría recogeremos la muestra con un portaobjetos para poder traspasarla al baño de agua caliente, y de este modo poder eliminar las posibles arrugas que se hayan originado durante el corte.
Deben recogerse las muestras nuevamente del baño de agua caliente con el portaobjetos con bastante cuidando y teniendo en cuenta el lado correcto del portaobjetos; este procedimiento se denomina “Pesca”.
Una vez hayamos finalizado el corte, limpiamos el portaobjetos por detrás y se le pone el nombre para poder identificarlo.

HEMATOXILINA-EOSINA

1º- Lo primero que debemos hacer antes de comenzar es filtrar la Hematoxilina, una vez filtrada procedemos a la tinción.

2º- El proceso empieza desparafinando en la estufa (37° overnight o 10 minutos en la estufa a 60°).

3º- Cogemos  la muestra y la introducimos de 5-10 minutos en Xilol para desparafinar, descubrimos y repetimos el proceso en el segundo Xilol y nuevamente en el tercero, lo sacamos y lo secamos un
poco.

4º- Procedemos a hidratar la muestra pasándola por al menos 5-6 pasos de Etanol a concentración decreciente ( 100°,96°,80°…) de 3-5 minutos en cada uno.

5º- Lo pasamos por agua y agitamos hasta que no veamos “marcas”, y escurrimos.

6º- Seguidamente metemos la muestra en la Hematoxilina previamente filtrada y nos llevamos el coplin a la pila a esperar de 3-5 minutos.

7º- Lo metemos en otro coplin con agua donde lo aclaramos dejando correr el agua.

8- Metemos y sacamos rápido la muestra en el alcohol clorhídrico (diferenciar) para eliminar el 

exceso de coloración y un paso rápido en agua corriente.

9- Lo metemos en Eosina de 3-5 minutos, lo descubrimos y le damos una pasada rápida por agua corriente.

10- Ahora procedemos a la deshidratación con alcoholes a concentraciones crecientes (…,70°,80°,96°,100°) rápidamente y dejándolo en el último Etanol unos 5 minutos.

Finalmente pasamos a los Xiloles rápidos y lo dejamos 5 minutos en el último.

RESULTADOS:

Los núcleos, se tiñen de color azul con la hematoxilina

La eosina tiñe de rosa más o menos intenso estructuras acidófilas (las fibras de colágeno.)

TRICROMICO DE MASON

            COLORANTES:

Hematoxilina: núcleos en azul

Fucsina de Ponceau: eritrocitos en fucsia y citoplasmas
            en azul-violáceo

Azul de Anilina: dará un color azul a la muestra.

Orange G: naranja los eritrocitos (no forma parte de la tinción)

Ácido fosfomolíbdico: acentúa la tinción de los demás colorantes

PROCEDIMIENTO:

    Desparafinación:

                                       -Estufa 60 -10 min

               -Xilol 3 pases de 5 min

Hidratación:

               -Etanol 96 ---1 min

               -Etanol 80---1 min

               -Etanol 60---1 min

               -Lavar con agua corriente------- Ir mirando la superficie
                 y cambiar el agua.             

     Tinción:

               -Hematoxilina de Harris---5 min (mover un poco)

               -Lavar en la cubeta de agua, cambiar el agua y dejar
                que corre el agua un poco hasta que salga limpia.

               -Baño rápido en agua acética (1%)

               -Baño rápido en agua corriente

               -Fucsina de ponceau 5 min (agitar)

               -Baño rápido en agua corriente (4 toques tranquilos)

               -Baño rápido con agua acética (no lavar después)

               -Orange G o ácido fosfomolibdico 5 min

               -Baño rápido en agua acética

               -Azul de anilina 10 min (agitarlo)

               -Dos pasadas rápidas en agua corriente

                                       -Agua acética (dos pasadas rápidas)

               -Baño rápido en agua corriente

              

Deshidratación: 

                                                   -Etanol 60 (6 sacudidas)

                                                   -Etanol 80 (10 sacudidas) dos veces (2 etanoles adicionales)

                                                   -Etanol 100 (5 min)

                                       -Xilol --- 5 min en los xiloles que tengamos


RESULTADO:

                Fibras de colágeno --------------------azul

                Tejido conjuntivo y citoplasmas---- rojo

                Núcleos---------------------------------morados  

TÉCNICA DEL PAS

PROCEDIMIENTO TÉCNICO:

 Fijación:

Formol al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin.

Reactivos:

 - Ácido Periódico……………0.5 % p/v.

 - Reactivo de Schiff: o Fucsina básica (CI: 42510)………… 1g.

 -Agua destilada……………………... 200 ml.

- Disolver la fucsina en 200 ml de agua destilada hirviendo.

- Dejar enfriar hasta aproximadamente 50º C. y filtrar

- Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Después enfriar hasta 25º C y añadir 1g de     Bisulfito sódico o Metabisulfito potásico (sódico).

- Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 días o a veces 24h en tornarse de color amarillo que indica que está listo para su uso.

- Añadir 2g de carbón activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color.
La solución debe conservarse en el refrigerador protegido de la luz.

- Solución de agua sulfurosa: o Baño de Ácido Sulfuroso o Agua sulfurosa: o Ácido Clorhídrico (HCl) 1N…………… 5 ml. o Metabisulfito sódico 10 %……………... 6 ml. o Agua (d)………………………………... 100 ml.

 - Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson.

 -  Técnica de Tinción:

-Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes)

-Ácido periódico 0.5 %…………………………………… 5 min.

- Lavar en agua destilada  Reactivo de Schiff……………………………………….. 15- 30 min.

- Aclarar en 3 baños de agua sulfurosa…………………… 2 min. Cada uno.

- Lavar en agua corriente

- Colorante de contraste

- Lavar con agua corriente.

- Deshidratar, aclarar y montar.

RESULTADO:
Material PAS +: rojo oscuro a magenta

PAPANICOLAU

 
 

Utilizaremos las células de las muestras obtenidas en citologias a las cuales se les reliza un proceso de  centrifugación.

Las fijamos con etanol al 96⁰ durante 15-30 minutos y procedemos con la tinción.

PROCEDIMIENTO:

             

1.      Hidratación: Pasamos las muestras por los etanoles a concentraciones decrecientes (96⁰, 80⁰, 70⁰, 50⁰) 1 minuto en cada uno.

2.       1 minuto en el coplin con agua

3.       1-2 en la hematoxilina de Harris (según su maduración)

4.       Lavamos en agua 2 min

5.       Diferenciamos con alcohol clorhídrico 5 segundos.

6.       Neutralizar con carbonato de Litio 45 segundos (nosotros utilizaremos agua del grifo)

7.       Lavamos con agua

8.       Deshidratamos con etanoles a concentraciones crecientes (50⁰, 70⁰, 80⁰, 96⁰)

9.       Orange G de 3-6 minutos

10.   Etanol 96⁰ dos pases de 1 min

11.   EA 50⁰ o 60⁰ de 3-6 minutos

12.   Etanol 96⁰ dos pases de 1 minuto

13.   Xilol dos pases de 1 minuto en cada etanol

14.   Montar con Eukit®

RESULTADO:

Núcleos ------------------------azul oscuro

Núcleos con queratina-------naranja

Nucléolos y citoplasmas-----rosa/rojo 

MAY-GRÜNDWALD GIEMSA

Las muestras están secadas al aire.

MATERIALES:

·         La solución de giemsa está preparada extemporáneamente

·         Palangana

·         Varillas para poner las muestras

·         Micropipeta

PROCEDIMIENTO:

    1.     Colocamos los portas en la rejilla los cubrimos con la solución de       may-grünwald y lo dejamos 3 minutos

    2.     Sin lavar echamos agua destilada para diluirlo y lo dejamos 3    minutos

    3.     Lo escurrimos un poco y sin lavar le añadimos giemsa (preparada extemporáneamente) y lo dejamos 20 minutos

    4.     Lo escurrimos y lavamos con agua destilada

    5.     Lo dejamos escurrir a 45⁰ con la muestra hacia dentro



RESULTADO:
Los núcleos van del color azul al púrpura-negro.
Los citoplasmas de las células maduras aparecen de un color violeta muy pálido o marrón muy pálido.
Los glóbulos rojos, ricos en hemoglobina aparecen de colores entre rosados y beige.
Los gránulos de los neutrófilos aparecen de colores entre violeta y marrón.
Los gránulos de los eosinófilos aparecen de color naranja.
Los gránulos de los basófilos de color entre azul y negro.
Los gránulos de los linfocitos grandes aparecen de color púrpura.
Las células con gran producción de ARN (como linfocitos productores de inmunoglobulinas y células inmaduras) presentan un citoplasma de color azul intenso

PANOPTICO RÁPIDO

Las muestras vienen secadas al aire.

Utilizaremos cuatro coplins:

1.       Llenamos los coplins en orden, primero fijador, después el básico, el ácido y por último el agua.

2.       Metemos la muestra en el primer coplin y lo metemos y sacamos 5 veces.

3.       Metemos la muestra en el segundo coplin, y lo metemos y sacamos 5 veces.

4.       Pasamos al tercero, lo metemos y sacamos 5 veces.

5.       Por último lo metemos en el coplin con agua y lo metemos y sacamos 5 veces.

6.       Secamos la parte de atrás y lo dejamos secar a 45⁰ con la muestra hacia dentro.

Resultados:

                                   Eritrocitos -----rojo oscuro

                                   Neutrófilos----- núcleos: morados

                                   Citoplasmas: rosa

GIEMSA PARA CORTES

 Primero desparafinamos:

 Ponemos las secciones en la estufa 10 min a 60ºC o toda la noche a 37ºC, sumergir los portas en xilol  u otro disolvente de la parafina en concentraciones decrecientes.

Hidratación:

 Eliminar el xilol mediante un disolvente adecuado como el etanol en concentraciones decrecientes hasta el 0% (agua), sumergir en agua destilada (o de grifo) para que la muestra se hidrate, ya que la mayoría de los tintes tienen una base acuosa.

Tinción:

1-      Sumergir las muestras en una solución de Giemsa (filtrada y comercial, o al 30% en agua destilada) durante 1 hora, a Tª ambiente.

2-       Se lava con agua hasta que rebose

3-       Lavar con agua acética al 2% varias veces rápidamente, aunque puede llegar hasta 30 segundos (diferenciación)

4-       Se lava con agua corriente hasta que rebose

5-       Deshidratar con alcohol isopropílico (propanol)  (2 cambios al menos) (No usar etanol)

6-      Se sumerge en las distintas cubetas de xilol durante 5 minutos cada una.

7-       Tras este proceso, ya se puede montar.

Resultados:

                     

                        Eritrocitos……………………………….. Rojo ladrillo

                        Núcleos celulares……............................... morado

Granulaciones especificas……….. ............Rojo, rosa o morado

Citoplasmas…………………………….. ..Del rosa al azul (efecto giemsa)

Hueso……………………………………...azul

Bacterias y parásitos……………azul, (menos las rikettsias que se ven violetas)